奶粉中雙氰胺的檢測方法（HPLC-UV和HPLC-MS/MS法）

更新時間：2013-01-30

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北京時間1月25日凌晨消息，新西蘭牛奶中發(fā)現(xiàn)了有害物質(zhì)——雙氰胺。雙氰胺又名二氰二胺，縮寫DICY或DCD。雖然標準未對食品中的雙氰胺*，但高劑量的雙氰胺對人體是有毒的。
本文采用天津博納艾杰爾科技的Cleanert^® MAS-QuChERS-雙氰胺凈化管和Venusil^® HILIC液相色譜柱，建立了奶粉中雙氰胺的MAS-QuEChERS快速前處理方法和LC-UV以及LC-MS/MS檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料
液相色譜儀，渦旋振蕩器，超聲波清洗機，氮吹儀。
雙氰胺標準品（CAS： 461-58-5；FW=84.08），Cleanert^® MAS-QuChERS-雙氰胺凈化管，Venusil^® HILIC液相色譜柱，微孔濾膜，乙酸銨、乙酸、乙腈為色譜純，實驗用水為超純水。

1.2 實驗步驟
提取、凈化：稱取1g試樣于50mL具塞離心管中，加入2mL水溶解后，加乙腈定容至10mL，超聲10min，8000r/min離心5min，取2mL上清液加入Cleanert^® MAS-QuChERS-雙氰胺凈化管填料，渦旋0.5min，8000r/min離心5min，取上清液過0.22µm濾膜，待測。

1.3　實驗條件
1.3.1液相色譜法（HPLC法）：
色譜柱：Venusil^® HILIC（5μm，100Å，4.6*250mm）；
流動相： 10mmol/L乙酸銨（pH=4.0）：乙腈=10: 90；
波長：220nm；進樣量：10µl；柱溫：30℃；流速：1mL/min。
1.3.2 LC-MS/MS法：
（1）色譜條件：
色譜柱：Venusil^® HILIC（ 5μm，100Å，2.1*150mm）；
流動相： 0.5mmol/L乙酸銨（pH=4.0）：乙腈=10:90；進樣量：10µL；柱溫：30℃；流速：0.2 mL/min。
（2）質(zhì)譜條件：
質(zhì)譜儀：API 4000+；離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；CAD：8.00；CUR：10.00；GS1：60.00；GS2：50.00；IS：5500.00；TEM：500.00。

表1雙氰胺質(zhì)譜信息

藥物名稱	監(jiān)測離子對	DP	EP	CE	CXP
雙氰胺	85.1/68.1	71	10	41	6
	85.1/43.1	71	10	41	6

注：帶“____”的監(jiān)測離子對為定量離子對。

2.結(jié)果與討論

2.1 液相色譜法：

2.1.1線性關(guān)系和檢出限
準確稱取雙氰胺標準品50mg于50mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，作為標準貯備液；
分別量取一定量的標準貯備液，用乙腈稀釋，配置成濃度為0.1µg/mL，0.5µg/mL，1.0µg/mL，2.0µg/mL，5.0µg/mL和10.0µg/mL的標準溶液，按照上述色譜條件，依次進樣檢測。以標準溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，擬合線性方程，結(jié)果見表2：

表2 雙氰胺線性方程和定量限（HPLC法）

名稱	保留時間	線性方程	相關(guān)系數(shù)	zui低定量限（S/N=10）
雙氰胺	4.92min	Y=116.44X+3.2699	0.9997	0.1µg/ml

2.1.2檢測方法穩(wěn)定性考察
選用10.0µg/mL的標準溶液連續(xù)進樣6針，計算其保留時間和峰面積的RSD值，結(jié)果見表3：

表3 檢測方法定性和定量穩(wěn)定性考察考察（HPLC法）

標號	保留時間/ min	峰面積
1	4.930	1061.7
2	4.933	1072.2
3	4.930	1064.4
4	4.929	1079.7
5	4.930	1067.3
6	4.934	1073.6
RSD，%	0.04	0.62

2.1.3準確度和精密度
選取市售某品牌奶粉試樣，進行添加回收實驗，結(jié)果見表4

表4 10µg/g添加回收實驗結(jié)果（HPLC法）

平行1，%	平行2，%	平行3，%	平均值，%	RSD，%
98.6	88.4	89.8	92.3	5.99

2.2 LC-MS/MS法

2.2.1線性關(guān)系和檢出限
準確稱取雙氰胺標準品50mg于50mL容量瓶中，加水溶液并稀釋至刻度，作為標準貯備液。
分別量取一定量的標準貯備液，用乙腈稀釋，配置成濃度為5ng/mL，10ng/mL，20ng/mL，50ng/mL，100ng/mL和500ng/mL的標準溶液，按照上述液質(zhì)方法，依次進樣檢測。以標準溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，擬合線性方程，結(jié)果見下表5：

表5 雙氰胺線性方程和定量限（LC-MS/MS法）

名稱	保留時間	線性方程	相關(guān)系數(shù)	zui低定量限（S/N=10）
雙氰胺	3.15min	Y=8777.2X+7435.9	0.9993	5ng/mL

2.2.2 檢測方法穩(wěn)定性考察
選用50.0ng/mL的標準溶液連續(xù)進樣6針，計算其保留時間和峰面積的RSD值，結(jié)果見表6：

表6 檢測方法定性和定量穩(wěn)定性考察考察（LC-MS/MS法）

標號	保留時間，min	峰面積
1	3.29	382950
2	3.30	387950
3	3.25	382840
4	3.31	399820
5	3.30	378580
6	3.30	383810
RSD，%	0.65	1.92

2.2.3準確度和精密度
選取市售某品牌奶粉試樣，進行添加回收實驗，結(jié)果見表7。采用空白樣品稀釋法判斷檢測方法的基質(zhì)效應(yīng)影響。空白凈化液稀釋和乙腈稀釋的標準溶液，雙氰胺峰面積和相對豐度比無明顯變化，故判斷該方法無基質(zhì)效應(yīng)的影響。

表7 100ng/g添加回收實驗結(jié)果

平行1	平行2	平行3	平均值	RSD
84.6%	80.7%	90.2%	85.2%	5.61%

3 產(chǎn)品訂貨信息

產(chǎn)品名稱	規(guī)格型號	貨號
MAS-QuChERS-雙氰胺凈化管	100mg/2mL，50支/包	MS-SQA01
Venusil HILIC液相色譜柱	4.6*250mm，5μm，100Å	VH952505-0
Venusil HILIC液相色譜柱	2.1*150mm，5μm，100Å	VH951502-0
微孔濾膜	0.22μm，直徑13mm, 200/Pk	AM021320
雙氰胺對照品	500mg /瓶，含量≥99.0%	DCD001
雙氰胺對照品	1g /瓶，含量≥99.0%	DCD002
離心管	50mL，帶螺紋蓋，25個/包	LXG0050
一次性無菌注射器	5mL,100/pk	ZSQ-5ML

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